# HG changeset patch # User triasteran # Date 1648557676 0 # Node ID b15d43a50435033a0786daba10193a60af3c3113 # Parent 6cbd0a215724698bc0aec59f14da62be9b6360b0 Uploaded diff -r 6cbd0a215724 -r b15d43a50435 trips_bam_to_sqlite/Dockerfile --- a/trips_bam_to_sqlite/Dockerfile Wed Mar 09 15:17:02 2022 +0000 +++ /dev/null Thu Jan 01 00:00:00 1970 +0000 @@ -1,20 +0,0 @@ -FROM alpine -WORKDIR /tmp -COPY bam_to_sqlite.py . -RUN chmod +x bam_to_sqlite.py -RUN ln bam_to_sqlite.py /usr/local/bin/bam_to_sqlite -RUN export PATH="$PATH:/usr/local/bin" -ENV PATH="/usr/local/bin:${PATH}" -RUN apk add bash -RUN apk add build-base -RUN apk add python3 -RUN apk add py3-pip -RUN apk add gcc g++ make libffi-dev openssl-dev -RUN apk add jpeg-dev zlib-dev -ENV LIBRARY_PATH=/lib:/usr/lib -RUN apk add libbz2 bzip2-dev xz-dev -RUN apk add python3-dev -RUN pip install --upgrade pip -RUN pip install --no-cache-dir 'pysqlite3==0.4.6' -RUN pip install --no-cache-dir 'pysam==0.16.0.1' -RUN pip install --no-cache-dir 'sqlitedict==1.7.0' diff -r 6cbd0a215724 -r b15d43a50435 trips_bam_to_sqlite/bam_to_sqlite.py --- a/trips_bam_to_sqlite/bam_to_sqlite.py Wed Mar 09 15:17:02 2022 +0000 +++ /dev/null Thu Jan 01 00:00:00 1970 +0000 @@ -1,582 +0,0 @@ -#!/usr/bin/env python3 - -import sys -import pysam -import operator -import os -import time -import sqlite3 -from sqlitedict import SqliteDict -import subprocess -from subprocess import call -import pickle - -print(pickle.format_version) - - -def tran_to_genome(tran, pos, transcriptome_info_dict): - #print ("tran",list(transcriptome_info_dict)) - traninfo = transcriptome_info_dict[tran] - chrom = traninfo["chrom"] - strand = traninfo["strand"] - exons = traninfo["exons"] - #print exons - if strand == "+": - exon_start = 0 - for tup in exons: - exon_start = tup[0] - exonlen = tup[1] - tup[0] - if pos > exonlen: - pos = (pos - exonlen)-1 - else: - break - genomic_pos = (exon_start+pos)-1 - elif strand == "-": - exon_start = 0 - for tup in exons[::-1]: - exon_start = tup[1] - exonlen = tup[1] - tup[0] - if pos > exonlen: - pos = (pos - exonlen)-1 - else: - break - genomic_pos = (exon_start-pos)+1 - return (chrom, genomic_pos) - - -# Takes a dictionary with a readname as key and a list of lists as value, each sub list has consists of two elements a transcript and the position the read aligns to in the transcript -# This function will count the number of genes that the transcripts correspond to and if less than or equal to 3 will add the relevant value to transcript_counts_dict -def processor(process_chunk, master_read_dict, transcriptome_info_dict,master_dict,readseq, unambig_read_length_dict): - readlen = len(readseq) - ambiguously_mapped_reads = 0 - #get the read name - read = list(process_chunk.keys())[0] - - read_list = process_chunk[read] # a list of lists of all transcripts the read aligns to and the positions - #used to store different genomic poistions - genomic_positions = [] - - #This section is just to get the different genomic positions the read aligns to - - for listname in process_chunk[read]: - - tran = listname[0].replace("-","_").replace("(","").replace(")","") - - pos = int(listname[1]) - genomic_pos = tran_to_genome(tran, pos, transcriptome_info_dict) - #print ("genomic pos",genomic_pos) - if genomic_pos not in genomic_positions: - genomic_positions.append(genomic_pos) - - #If the read maps unambiguously - if len(genomic_positions) == 1: - if readlen not in unambig_read_length_dict: - unambig_read_length_dict[readlen] = 0 - unambig_read_length_dict[readlen] += 1 - #assume this read aligns to a noncoding position, if we find that it does align to a coding region change this to True - coding=False - - # For each transcript this read alings to - for listname in process_chunk[read]: - #get the transcript name - tran = listname[0].replace("-","_").replace("(","").replace(")","") - #If we haven't come across this transcript already then add to master_read_dict - if tran not in master_read_dict: - master_read_dict[tran] = {"ambig":{}, "unambig":{}, "mismatches":{}, "seq":{}} - #get the raw unedited positon, and read tags - pos = int(listname[1]) - read_tags = listname[2] - #If there is mismatches in this line, then modify the postion and readlen (if mismatches at start or end) and add mismatches to dictionary - nm_tag = 0 - - for tag in read_tags: - if tag[0] == "NM": - nm_tag = int(tag[1]) - if nm_tag > 0: - md_tag = "" - for tag in read_tags: - if tag[0] == "MD": - md_tag = tag[1] - pos_modifier, readlen_modifier,mismatches = get_mismatch_pos(md_tag,pos,readlen,master_read_dict,tran,readseq) - # Count the mismatches (we only do this for unambiguous) - for mismatch in mismatches: - #Ignore mismatches appearing in the first position (due to non templated addition) - if mismatch != 0: - char = mismatches[mismatch] - mismatch_pos = pos + mismatch - if mismatch_pos not in master_read_dict[tran]["seq"]: - master_read_dict[tran]["seq"][mismatch_pos] = {} - if char not in master_read_dict[tran]["seq"][mismatch_pos]: - master_read_dict[tran]["seq"][mismatch_pos][char] = 0 - master_read_dict[tran]["seq"][mismatch_pos][char] += 1 - # apply the modifiers - pos = pos+pos_modifier - readlen = readlen - readlen_modifier - - - try: - cds_start = transcriptome_info_dict[tran]["cds_start"] - cds_stop = transcriptome_info_dict[tran]["cds_stop"] - - if pos >= cds_start and pos <= cds_stop: - coding=True - except: - pass - - - if readlen in master_read_dict[tran]["unambig"]: - if pos in master_read_dict[tran]["unambig"][readlen]: - master_read_dict[tran]["unambig"][readlen][pos] += 1 - else: - master_read_dict[tran]["unambig"][readlen][pos] = 1 - else: - master_read_dict[tran]["unambig"][readlen] = {pos:1} - - if coding == True: - master_dict["unambiguous_coding_count"] += 1 - elif coding == False: - master_dict["unambiguous_non_coding_count"] += 1 - - else: - ambiguously_mapped_reads += 1 - for listname in process_chunk[read]: - tran = listname[0].replace("-","_").replace("(","").replace(")","") - if tran not in master_read_dict: - master_read_dict[tran] = {"ambig":{}, "unambig":{}, "mismatches":{}, "seq":{}} - pos = int(listname[1]) - read_tags = listname[2] - nm_tag = 0 - for tag in read_tags: - if tag[0] == "NM": - nm_tag = int(tag[1]) - if nm_tag > 0: - md_tag = "" - for tag in read_tags: - if tag[0] == "MD": - md_tag = tag[1] - pos_modifier, readlen_modifier,mismatches = get_mismatch_pos(md_tag,pos,readlen,master_read_dict,tran,readseq) - # apply the modifiers - pos = pos+pos_modifier - readlen = readlen - readlen_modifier - if readlen in master_read_dict[tran]["ambig"]: - if pos in master_read_dict[tran]["ambig"][readlen]: - master_read_dict[tran]["ambig"][readlen][pos] += 1 - else: - master_read_dict[tran]["ambig"][readlen][pos] = 1 - else: - master_read_dict[tran]["ambig"][readlen] = {pos:1} - return ambiguously_mapped_reads - -def get_mismatch_pos(md_tag,pos,readlen,master_read_dict,tran,readseq): - nucs = ["A","T","G","C"] - mismatches = {} - total_so_far = 0 - prev_char = "" - for char in md_tag: - if char in nucs: - if prev_char != "": - total_so_far += int(prev_char) - prev_char = "" - mismatches[total_so_far+len(mismatches)] = (readseq[total_so_far+len(mismatches)]) - else: - if char != "^" and char != "N": - if prev_char == "": - prev_char = char - else: - total_so_far += int(prev_char+char) - prev_char = "" - readlen_modifier = 0 - pos_modifier = 0 - five_ok = False - three_ok = False - while five_ok == False: - for i in range(0,readlen): - if i in mismatches: - pos_modifier += 1 - readlen_modifier += 1 - else: - five_ok = True - break - five_ok = True - - - while three_ok == False: - for i in range(readlen-1,0,-1): - if i in mismatches: - readlen_modifier += 1 - else: - three_ok = True - break - three_ok = True - - - return (pos_modifier, readlen_modifier, mismatches) - - - -def process_bam(bam_filepath, transcriptome_info_dict_path,outputfile): - desc = "NULL" - start_time = time.time() - study_dict ={} - nuc_count_dict = {"mapped":{},"unmapped":{}} - dinuc_count_dict = {} - threeprime_nuc_count_dict = {"mapped":{},"unmapped":{}} - read_length_dict = {} - unambig_read_length_dict = {} - unmapped_dict = {} - master_dict = {"unambiguous_non_coding_count":0,"unambiguous_coding_count":0,"current_dir":os.getcwd()} - - transcriptome_info_dict = {} - connection = sqlite3.connect(transcriptome_info_dict_path) - cursor = connection.cursor() - cursor.execute("SELECT transcript,cds_start,cds_stop,length,strand,chrom,tran_type from transcripts;") - result = cursor.fetchall() - for row in result: - transcriptome_info_dict[str(row[0])] = {"cds_start":row[1],"cds_stop":row[2],"length":row[3],"strand":row[4],"chrom":row[5],"exons":[],"tran_type":row[6]} - #print transcriptome_info_dict.keys()[:10] - - cursor.execute("SELECT * from exons;") - result = cursor.fetchall() - for row in result: - transcriptome_info_dict[str(row[0])]["exons"].append((row[1],row[2])) - - #it might be the case that there are no multimappers, so set this to 0 first to avoid an error, it will be overwritten later if there is multimappers - multimappers = 0 - unmapped_reads = 0 - unambiguous_coding_count = 0 - unambiguous_non_coding_count = 0 - trip_periodicity_reads = 0 - - final_offsets = {"fiveprime":{"offsets":{}, "read_scores":{}}, "threeprime":{"offsets":{}, "read_scores":{}}} - master_read_dict = {} - prev_seq = "" - process_chunk = {"read_name":[["placeholder_tran","1","28"]]} - mapped_reads = 0 - ambiguously_mapped_reads = 0 - master_trip_dict = {"fiveprime":{}, "threeprime":{}} - master_offset_dict = {"fiveprime":{}, "threeprime":{}} - master_metagene_stop_dict = {"fiveprime":{}, "threeprime":{}} - - - infile = pysam.Samfile(bam_filepath, "rb") - header = infile.header["HD"]; print (header) - unsorted = False - if "SO" in header: - if header["SO"] != "queryname": - unsorted = True - else: - unsorted = True - if unsorted == True: - print ("ERROR: Bam file appears to be unsorted or not sorted by read name. To sort by read name use the command: samtools sort -n input.bam output.bam") - print (header, 'SO in header', header['SO'], bam_filepath) - sys.exit() - total_bam_lines = 0 - all_ref_ids = infile.references - - for read in infile.fetch(until_eof=True): - total_bam_lines += 1 - if not read.is_unmapped: - ref = read.reference_id - tran = (all_ref_ids[ref]).split(".")[0] - mapped_reads += 1 - if mapped_reads%1000000 == 0: - print ("{} reads parsed at {}".format(mapped_reads,(time.time()-start_time))) - pos = read.reference_start - readname = read.query_name - read_tags = read.tags - if readname == list(process_chunk.keys())[0]: - process_chunk[readname].append([tran,pos,read_tags]) - #if the current read is different from previous reads send 'process_chunk' to the 'processor' function, then start 'process_chunk' over using current read - else: - if list(process_chunk.keys())[0] != "read_name": - - #At this point we work out readseq, we do this for multiple reasons, firstly so we don't count the sequence from a read multiple times, just because - # it aligns multiple times and secondly we only call read.seq once (read.seq is computationally expensive) - seq = read.seq - readlen = len(seq) - - # Note if a read maps ambiguously it will still be counted toward the read length distribution (however it will only be counted once, not each time it maps) - if readlen not in read_length_dict: - read_length_dict[readlen] = 0 - read_length_dict[readlen] += 1 - - if readlen not in nuc_count_dict["mapped"]: - nuc_count_dict["mapped"][readlen] = {} - if readlen not in threeprime_nuc_count_dict["mapped"]: - threeprime_nuc_count_dict["mapped"][readlen] = {} - if readlen not in dinuc_count_dict: - dinuc_count_dict[readlen] = {"AA":0, "TA":0, "GA":0, "CA":0, - "AT":0, "TT":0, "GT":0, "CT":0, - "AG":0, "TG":0, "GG":0, "CG":0, - "AC":0, "TC":0, "GC":0, "CC":0} - - for i in range(0,len(seq)): - if i not in nuc_count_dict["mapped"][readlen]: - nuc_count_dict["mapped"][readlen][i] = {"A":0, "T":0, "G":0, "C":0, "N":0} - nuc_count_dict["mapped"][readlen][i][seq[i]] += 1 - - for i in range(0,len(seq)): - try: - dinuc_count_dict[readlen][seq[i:i+2]] += 1 - except: - pass - - for i in range(len(seq),0,-1): - dist = i-len(seq) - if dist not in threeprime_nuc_count_dict["mapped"][readlen]: - threeprime_nuc_count_dict["mapped"][readlen][dist] = {"A":0, "T":0, "G":0, "C":0, "N":0} - threeprime_nuc_count_dict["mapped"][readlen][dist][seq[dist]] += 1 - ambiguously_mapped_reads += processor(process_chunk, master_read_dict, transcriptome_info_dict,master_dict,prev_seq, unambig_read_length_dict) - process_chunk = {readname:[[tran, pos, read_tags]]} - prev_seq = read.seq - else: - unmapped_reads += 1 - - # Add this unmapped read to unmapped_dict so we can see what the most frequent unmapped read is. - seq = read.seq - readlen = len(seq) - if seq in unmapped_dict: - unmapped_dict[seq] += 1 - else: - unmapped_dict[seq] = 1 - - # Populate the nuc_count_dict with this unmapped read - if readlen not in nuc_count_dict["unmapped"]: - nuc_count_dict["unmapped"][readlen] = {} - for i in range(0,len(seq)): - if i not in nuc_count_dict["unmapped"][readlen]: - nuc_count_dict["unmapped"][readlen][i] = {"A":0, "T":0, "G":0, "C":0, "N":0} - nuc_count_dict["unmapped"][readlen][i][seq[i]] += 1 - - if readlen not in threeprime_nuc_count_dict["unmapped"]: - threeprime_nuc_count_dict["unmapped"][readlen] = {} - - for i in range(len(seq),0,-1): - dist = i-len(seq) - if dist not in threeprime_nuc_count_dict["unmapped"][readlen]: - threeprime_nuc_count_dict["unmapped"][readlen][dist] = {"A":0, "T":0, "G":0, "C":0, "N":0} - threeprime_nuc_count_dict["unmapped"][readlen][dist][seq[dist]] += 1 - - #add stats about mapped/unmapped reads to file dict which will be used for the final report - master_dict["total_bam_lines"] = total_bam_lines - master_dict["mapped_reads"] = mapped_reads - master_dict["unmapped_reads"] = unmapped_reads - master_read_dict["unmapped_reads"] = unmapped_reads - master_dict["ambiguously_mapped_reads"] = ambiguously_mapped_reads - - if "read_name" in master_read_dict: - del master_read_dict["read_name"] - print ("BAM file processed") - print ("Creating metagenes, triplet periodicity plots, etc.") - for tran in master_read_dict: - try: - cds_start = transcriptome_info_dict[tran]["cds_start"] - cds_stop = transcriptome_info_dict[tran]["cds_stop"] - except: - continue - - tranlen = transcriptome_info_dict[tran]["length"] - #Use this to discard transcripts with no 5' leader or 3' trailer - if cds_start > 1 and cds_stop < tranlen and transcriptome_info_dict[tran]["tran_type"] == 1: - for primetype in ["fiveprime", "threeprime"]: - # Create the triplet periodicity and metainfo plots based on both the 5' and 3' ends of reads - for readlength in master_read_dict[tran]["unambig"]: - #print "readlength", readlength - # for each fiveprime postion for this readlength within this transcript - for raw_pos in master_read_dict[tran]["unambig"][readlength]: - #print "raw pos", raw_pos - trip_periodicity_reads += 1 - if primetype == "fiveprime": - # get the five prime postion minus the cds start postion - real_pos = raw_pos-cds_start - rel_stop_pos = raw_pos-cds_stop - elif primetype == "threeprime": - real_pos = (raw_pos+readlength)-cds_start - rel_stop_pos = (raw_pos+readlength)-cds_stop - #get the readcount at the raw postion - readcount = master_read_dict[tran]["unambig"][readlength][raw_pos] - #print "readcount", readcount - frame = (real_pos%3) - if readlength in master_trip_dict[primetype]: - master_trip_dict[primetype][readlength][str(frame)] += readcount - else: - master_trip_dict[primetype][readlength]= {"0":0.0,"1":0.0,"2":0.0} - master_trip_dict[primetype][readlength][str(frame)] += readcount - # master trip dict is now made up of readlengths with 3 frames and a count associated with each frame - # create a 'score' for each readlength by putting the max frame count over the second highest frame count - for subreadlength in master_trip_dict[primetype]: - maxcount = 0 - secondmaxcount = 0 - for frame in master_trip_dict[primetype][subreadlength]: - if master_trip_dict[primetype][subreadlength][frame] > maxcount: - maxcount = master_trip_dict[primetype][subreadlength][frame] - for frame in master_trip_dict[primetype][subreadlength]: - if master_trip_dict[primetype][subreadlength][frame] > secondmaxcount and master_trip_dict[primetype][subreadlength][frame] != maxcount: - secondmaxcount = master_trip_dict[primetype][subreadlength][frame] - # a perfect score would be 0 meaning there is only a single peak, the worst score would be 1 meaning two highest peaks are the same height - master_trip_dict[primetype][subreadlength]["score"] = float(secondmaxcount)/float(maxcount) - - - # now populate offset dict with the 'real_positions' upstream of cds_start, these will be used for metainfo dict - if real_pos > (-600) and real_pos < (601): - if readlength in master_offset_dict[primetype]: - if real_pos in master_offset_dict[primetype][readlength]: - #print "real pos in offset dict" - master_offset_dict[primetype][readlength][real_pos] += readcount - else: - #print "real pos not in offset dict" - master_offset_dict[primetype][readlength][real_pos] = readcount - else: - #initiliase with zero to avoid missing neighbours below - #print "initialising with zeros" - master_offset_dict[primetype][readlength]= {} - for i in range(-600,601): - master_offset_dict[primetype][readlength][i] = 0 - master_offset_dict[primetype][readlength][real_pos] += readcount - - # now populate offset dict with the 'real_positions' upstream of cds_start, these will be used for metainfo dict - if rel_stop_pos > (-600) and rel_stop_pos < (601): - if readlength in master_metagene_stop_dict[primetype]: - if rel_stop_pos in master_metagene_stop_dict[primetype][readlength]: - master_metagene_stop_dict[primetype][readlength][rel_stop_pos] += readcount - else: - master_metagene_stop_dict[primetype][readlength][rel_stop_pos] = readcount - else: - #initiliase with zero to avoid missing neighbours below - master_metagene_stop_dict[primetype][readlength] = {} - for i in range(-600,601): - master_metagene_stop_dict[primetype][readlength][i] = 0 - master_metagene_stop_dict[primetype][readlength][rel_stop_pos] += readcount - - #This part is to determine what offsets to give each read length - print ("Calculating offsets") - for primetype in ["fiveprime", "threeprime"]: - for readlen in master_offset_dict[primetype]: - accepted_len = False - max_relative_pos = 0 - max_relative_count = 0 - for relative_pos in master_offset_dict[primetype][readlen]: - # This line is to ensure we don't choose an offset greater than the readlength (in cases of a large peak far up/downstream) - if abs(relative_pos) < 10 or abs(relative_pos) > (readlen-10): - continue - if master_offset_dict[primetype][readlen][relative_pos] > max_relative_count: - max_relative_pos = relative_pos - max_relative_count = master_offset_dict[primetype][readlen][relative_pos] - #print "for readlen {} the max_relative pos is {}".format(readlen, max_relative_pos) - if primetype == "fiveprime": - # -3 to get from p-site to a-site, +1 to account for 1 based co-ordinates, resulting in -2 overall - final_offsets[primetype]["offsets"][readlen] = abs(max_relative_pos-2) - elif primetype == "threeprime": - # +3 to get from p-site to a-site, -1 to account for 1 based co-ordinates, resulting in +2 overall - final_offsets[primetype]["offsets"][readlen] = (max_relative_pos*(-1))+2 - final_offsets[primetype]["read_scores"][readlen] = master_trip_dict[primetype][readlen]["score"] - - master_read_dict["offsets"] = final_offsets - master_read_dict["trip_periodicity"] = master_trip_dict - master_read_dict["desc"] = "Null" - master_read_dict["mapped_reads"] = mapped_reads - master_read_dict["nuc_counts"] = nuc_count_dict - master_read_dict["dinuc_counts"] = dinuc_count_dict - master_read_dict["threeprime_nuc_counts"] = threeprime_nuc_count_dict - master_read_dict["metagene_counts"] = master_offset_dict - master_read_dict["stop_metagene_counts"] = master_metagene_stop_dict - master_read_dict["read_lengths"] = read_length_dict - master_read_dict["unambig_read_lengths"] = unambig_read_length_dict - master_read_dict["coding_counts"] = master_dict["unambiguous_coding_count"] - master_read_dict["noncoding_counts"] = master_dict["unambiguous_non_coding_count"] - master_read_dict["ambiguous_counts"] = master_dict["ambiguously_mapped_reads"] - master_read_dict["frequent_unmapped_reads"] = (sorted(unmapped_dict.items(), key=operator.itemgetter(1)))[-2000:] - master_read_dict["cutadapt_removed"] = 0 - master_read_dict["rrna_removed"] = 0 - #If no reads are removed by minus m there won't be an entry in the log file, so initiliase with 0 first and change if there is a line - master_read_dict["removed_minus_m"] = 0 - master_dict["removed_minus_m"] = 0 - # We work out the total counts for 5', cds 3' for differential translation here, would be better to do thisn in processor but need the offsets - master_read_dict["unambiguous_all_totals"] = {} - master_read_dict["unambiguous_fiveprime_totals"] = {} - master_read_dict["unambiguous_cds_totals"] = {} - master_read_dict["unambiguous_threeprime_totals"] = {} - - master_read_dict["ambiguous_all_totals"] = {} - master_read_dict["ambiguous_fiveprime_totals"] = {} - master_read_dict["ambiguous_cds_totals"] = {} - master_read_dict["ambiguous_threeprime_totals"] = {} - print ("calculating transcript counts") - for tran in master_read_dict: - if tran in transcriptome_info_dict: - five_total = 0 - cds_total = 0 - three_total = 0 - - ambig_five_total = 0 - ambig_cds_total = 0 - ambig_three_total = 0 - - cds_start = transcriptome_info_dict[tran]["cds_start"] - cds_stop = transcriptome_info_dict[tran]["cds_stop"] - for readlen in master_read_dict[tran]["unambig"]: - if readlen in final_offsets["fiveprime"]["offsets"]: - offset = final_offsets["fiveprime"]["offsets"][readlen] - else: - offset = 15 - for pos in master_read_dict[tran]["unambig"][readlen]: - real_pos = pos+offset - if real_pos =cds_start and real_pos <= cds_stop: - cds_total += master_read_dict[tran]["unambig"][readlen][pos] - elif real_pos > cds_stop: - three_total += master_read_dict[tran]["unambig"][readlen][pos] - master_read_dict["unambiguous_all_totals"][tran] = five_total+cds_total+three_total - master_read_dict["unambiguous_fiveprime_totals"][tran] = five_total - master_read_dict["unambiguous_cds_totals"][tran] = cds_total - master_read_dict["unambiguous_threeprime_totals"][tran] = three_total - - for readlen in master_read_dict[tran]["ambig"]: - if readlen in final_offsets["fiveprime"]["offsets"]: - offset = final_offsets["fiveprime"]["offsets"][readlen] - else: - offset = 15 - for pos in master_read_dict[tran]["ambig"][readlen]: - real_pos = pos+offset - if real_pos =cds_start and real_pos <= cds_stop: - ambig_cds_total += master_read_dict[tran]["ambig"][readlen][pos] - elif real_pos > cds_stop: - ambig_three_total += master_read_dict[tran]["ambig"][readlen][pos] - - master_read_dict["ambiguous_all_totals"][tran] = five_total+cds_total+three_total+ambig_five_total+ambig_cds_total+ambig_three_total - master_read_dict["ambiguous_fiveprime_totals"][tran] = five_total+ambig_five_total - master_read_dict["ambiguous_cds_totals"][tran] = cds_total+ambig_cds_total - master_read_dict["ambiguous_threeprime_totals"][tran] = three_total+ambig_three_total - print ("Writing out to sqlite file") - sqlite_db = SqliteDict(outputfile,autocommit=False) - for key in master_read_dict: - sqlite_db[key] = master_read_dict[key] - sqlite_db["description"] = desc - sqlite_db.commit() - sqlite_db.close() - - -if __name__ == "__main__": - if len(sys.argv) <= 2: - print ("Usage: python bam_to_sqlite.py ") - sys.exit() - bam_filepath_uns = sys.argv[1] # name for unsorted file - bam_filepath = bam_filepath_uns.split('.bam')[0]+'_sort.bam'# name for temp sorted by name file would be: - pysam.sort("-n", "-o", bam_filepath, bam_filepath_uns) - #subprocess.call('samtools sort -n %s > %s' % (bam_filepath_uns, bam_filepath), shell=True) - print ('bam_filepath', bam_filepath) - infile_test = pysam.Samfile(bam_filepath, "rb") - header_test = infile_test.header["HD"]; print ('before process bam:', header_test) - annotation_sqlite_filepath = sys.argv[2] - #try: - # desc = sys.argv[3] - #except: - # desc = bam_filepath.split("/")[-1] - outputfile = sys.argv[3] - process_bam(bam_filepath,annotation_sqlite_filepath,outputfile) - print ('pickle protocol that was used for generating sqlite file') - print("highest protocol: ", pickle.HIGHEST_PROTOCOL) - diff -r 6cbd0a215724 -r b15d43a50435 trips_bam_to_sqlite/trips_bam_to_sqlite.xml --- a/trips_bam_to_sqlite/trips_bam_to_sqlite.xml Wed Mar 09 15:17:02 2022 +0000 +++ /dev/null Thu Jan 01 00:00:00 1970 +0000 @@ -1,36 +0,0 @@ - - - triasteran/bam_to_sqlite:latest - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -@misc{githubTrips-Viz, - author = {LastTODO, FirstTODO}, - year = {TODO}, - title = {Trips-Viz}, - publisher = {GitHub}, - journal = {GitHub repository}, - url = {https://github.com/skiniry/Trips-Viz}, -} - - diff -r 6cbd0a215724 -r b15d43a50435 trips_create_new_organism/Dockerfile --- /dev/null Thu Jan 01 00:00:00 1970 +0000 +++ b/trips_create_new_organism/Dockerfile Tue Mar 29 12:41:16 2022 +0000 @@ -0,0 +1,14 @@ +FROM alpine +WORKDIR /tmp +COPY create_annotation_sqlite.py . +RUN chmod +x create_annotation_sqlite.py +RUN ln create_annotation_sqlite.py /usr/local/bin/create_annotation_sqlite +RUN export PATH="$PATH:/usr/local/bin" +ENV PATH="/usr/local/bin:${PATH}" +RUN apk add bash +RUN apk add python3 +RUN apk add py3-pip +RUN pip install --upgrade pip +RUN pip install --no-cache-dir 'pysqlite3==0.4.6' +RUN pip install --no-cache-dir 'regex==2022.1.18' +RUN pip install --no-cache-dir 'intervaltree==3.1.0' diff -r 6cbd0a215724 -r b15d43a50435 trips_create_new_organism/create_annotation_sqlite.py --- /dev/null Thu Jan 01 00:00:00 1970 +0000 +++ b/trips_create_new_organism/create_annotation_sqlite.py Tue Mar 29 12:41:16 2022 +0000 @@ -0,0 +1,788 @@ +#!/usr/bin/env python3 + +# Python3 script which takes in an annotation file(gtf/gff3) and a transcriptomic fasta file +# and produces an sqlite file which can be uploaded to Trips-Viz +# All co-ordinates produced are 1 based +# All start codon positions (including cds_start) should be at the first nucleotide of the codon +# All stop codon positions (including cds_stop) should be at the last nucleotide of the codon +import sys +import re +import sqlite3 +import intervaltree +from intervaltree import Interval, IntervalTree +import itertools + +#This should be a GTF or GFF3 file +annotation_file = open(sys.argv[1],"r") +#This needs to be the transcriptomic fasta file +fasta_file = open(sys.argv[2],"r") +#This value will be added used to create UTRs of this length, useful when looking at transcriptomes without annotated UTRs +pseudo_utr_len = int(sys.argv[3]) +#An example of a transcript_id from the annotation file, e.g ENST000000123456 +user_transcript_id = sys.argv[4] +#An example of a gene name from the annotation file +user_gene_name = sys.argv[5] +# Set to true if transcript version is included in transcript_id, e.g: ENST000000123456.1 +TRAN_VERSION = True + + + +delimiters = {"transcripts":{"before":[],"after":[],"annot_types": ["cds","utr"]}, + "genes":{"before":[],"after":['"'],"annot_types": ["lnc_rna"]}} + +punctuation = [";"," ","-",":","-",".","=","\t"] +#Find delimiters in the annotation and fasta files using the user_transcript_id +#and user_gene_name examples given by user. +for line in annotation_file: + if user_transcript_id in line: + tabsplitline = line.split("\t") + annot_type = tabsplitline[2] + if annot_type not in delimiters["transcripts"]["annot_types"]: + delimiters["transcripts"]["annot_types"].append(annot_type.lower()) + splitline = line.split(user_transcript_id) + before_delimiter = splitline[0] + for item in punctuation: + if item in before_delimiter: + if len(before_delimiter.split(item)[-1]) >= 5: + before_delimiter = before_delimiter.split(item)[-1] + after_delimiter = splitline[1][:2] + if before_delimiter not in delimiters["transcripts"]["before"] and len(before_delimiter) >= 5: + delimiters["transcripts"]["before"].append(before_delimiter) + if after_delimiter not in delimiters["transcripts"]["after"]: + delimiters["transcripts"]["after"].append(after_delimiter) + if user_gene_name in line: + tabsplitline = line.split("\t") + annot_type = tabsplitline[2] + if annot_type not in delimiters["genes"]["annot_types"]: + delimiters["genes"]["annot_types"].append(annot_type.lower()) + splitline = line.split(user_gene_name) + before_delimiter = splitline[0] + for item in punctuation: + if item in before_delimiter: + if len(before_delimiter.split(item)[-1]) >= 5: + before_delimiter = before_delimiter.split(item)[-1] + after_delimiter = splitline[1][0] + if before_delimiter not in delimiters["genes"]["before"] and len(before_delimiter) >= 5: + delimiters["genes"]["before"].append(before_delimiter) + if after_delimiter not in delimiters["genes"]["after"]: + if after_delimiter in punctuation: + delimiters["genes"]["after"].append(after_delimiter) +for line in fasta_file: + if user_transcript_id in line: + splitline = line.split(user_transcript_id) + before_delimiter = splitline[0] + for item in punctuation: + if item in before_delimiter: + if len(before_delimiter.split(item)[1]) >= 5: + before_delimiter = before_delimiter.split(item)[1] + after_delimiter = splitline[1][0] + if before_delimiter not in delimiters["transcripts"]["before"] and len(before_delimiter) >= 5: + delimiters["transcripts"]["before"].append(before_delimiter) + if after_delimiter not in delimiters["transcripts"]["after"]: + delimiters["transcripts"]["after"].append(after_delimiter) +fasta_file.close() +annotation_file.close() + + + + + +if delimiters["transcripts"]["before"] == []: + print ("ERROR: No transcript_id with the name {} could be found in the annotation file".format(user_transcript_id)) + sys.exit() +if delimiters["genes"]["before"] == []: + print ("ERROR: No gene with the name {} could be found in the annotation file".format(user_gene_name)) + sys.exit() + +master_dict = {} +coding_dict = {} +notinfasta = open("notinfasta.csv","w") + +#Given a nucleotide sequence returns the positions of all start and stop codons. +def get_start_stops(transcript_sequence): + transcript_sequence = transcript_sequence.upper() + start_codons = ['ATG'] + stop_codons = ['TAA', 'TAG', 'TGA'] + seq_frames = {'starts': [], 'stops': []} + for codons, positions in ((start_codons, 'starts'),(stop_codons, 'stops')): + if len(codons) > 1: + pat = re.compile('|'.join(codons)) + else: + pat = re.compile(codons[0]) + for m in re.finditer(pat, transcript_sequence): + # Increment position by 1, Frame 1 starts at position 1 not 0, + # if it's a stop codon add another 2 so it points to the last nuc of the codon + if positions == "starts": + start = m.start() + 1 + else: + start = m.start() + 3 + seq_frames[positions].append(start) + return seq_frames + + +#parse fasta to get the nucleotide sequence of transcripts and the positions of start/stop codons. +fasta_file = open(sys.argv[2],"r") +read_fasta = fasta_file.read() +split_fasta = read_fasta.split(">") +for entry in split_fasta[1:]: + newline_split = entry.split("\n") + tran = newline_split[0] + for item in delimiters["transcripts"]["after"]: + if item in tran: + tran = tran.split(item)[0] + tran = tran.replace("-","_").replace("(","").replace(")","") + seq = ("".join(newline_split[1:])) + if "_PAR_Y" in tran: + tran += "_chrY" + elif "_PAR_X" in tran: + tran += "_chrX" + tran = tran.upper() + starts_stops = get_start_stops(seq) + if tran not in master_dict: + master_dict[tran] = {"utr":[], "cds":[], "exon":[],"start_codon":[],"stop_codon":[],"start_list":starts_stops["starts"], + "stop_list":starts_stops["stops"],"transcript":[], "strand":"" ,"gene_name":"","chrom":"","seq":seq,"cds_start":"NULL","cds_stop":"NULL", + "length":len(seq),"principal":0,"version":"NULL"} + + + + +def to_ranges(iterable): + tup_list = [] + iterable = sorted(set(iterable)) + for key, group in itertools.groupby(enumerate(iterable),lambda t: t[1] - t[0]): + group = list(group) + tup_list.append((group[0][1], group[-1][1])) + return tup_list + +#parse annotation file to get chromsome, exon location and CDS info for each transcript +def parse_gtf_file(annotation_file): + for line in annotation_file: + if line == "\n": + continue + if line[0] != '#': + splitline = (line.replace("\n","")).split("\t") + chrom = splitline[0] + try: + annot_type = splitline[2].lower() + except: + print ("ERROR tried to index to second item in splitline: ",splitline, line) + sys.exit() + #if annot_type not in ["cds", "utr", "exon", "transcript","five_prime_utr", "three_prime_utr","stop_codon","start_codon"]: + # continue + if annot_type not in delimiters["transcripts"]["annot_types"] and annot_type not in delimiters["genes"]["annot_types"]: + continue + if annot_type == "five_prime_utr" or annot_type == "three_prime_utr": + annot_type = "utr" + strand = splitline[6] + if strand == "+": + start = int(splitline[3]) + end = int(splitline[4]) + else: + start = int(splitline[3])+1 + end = int(splitline[4])+1 + desc = splitline[8] + tran = desc + gene = desc + for item in delimiters["transcripts"]["before"]: + if item in tran: + tran = tran.split(item)[1] + for item in delimiters["transcripts"]["after"]: + if item in tran: + tran = tran.split(item)[0] + if "." in tran and TRAN_VERSION == True: + #print ("raw tran",tran) + tran = tran.split(".") + version = int(tran[-1].split("_")[0]) + tran = tran[0] + else: + version = "NULL" + tran = tran.replace("-","_").replace(".","_") + tran = tran.replace("(","").replace(")","") + tran = tran.replace(" ","").replace("\t","") + tran = tran.upper() + tran = tran.replace("GENE_","").replace("ID_","") + #print ("tran",tran,version) + #if tran == "ENST00000316448": + # print ("annot type",annot_type) + # print ("appending exon to tran", start, end,line) + + gene_found = False + + if annot_type in delimiters["genes"]["annot_types"]: + for item in delimiters["genes"]["before"]: + if item in gene: + gene_found = True + gene = gene.split(item)[1] + for item in delimiters["genes"]["after"]: + if item in gene: + gene = gene.split(item)[0] + gene = gene.replace("'","''") + gene = gene.replace("GENE_","") + gene = gene.replace("ID_","") + gene = gene.upper() + + if tran in master_dict: + if annot_type in master_dict[tran]: + master_dict[tran][annot_type].append((start, end)) + master_dict[tran]["strand"] = strand + master_dict[tran]["chrom"] = chrom + master_dict[tran]["version"] = version + if gene_found == True: + master_dict[tran]["gene_name"] = gene + else: + notinfasta.write("{}\n".format(tran)) + +annotation_file = open(sys.argv[1],"r") +parse_gtf_file(annotation_file) + + +#remove transcripts that were in fasta file but not in annotation_file +notinannotation = [] +for tran in master_dict: + if master_dict[tran]["chrom"] == "": + #print ("tran {} has no chrom :(".format(tran)) + notinannotation.append(tran) +for tran in notinannotation: + del master_dict[tran] + +#Dictionary to store the coding status of a gene, if any transcript of this gene is coding, the value will be True +coding_genes_dict = {} +#parse master_dict to calculate length, cds_start/stop and exon junction positions +for tran in master_dict: + try: + transeq = master_dict[tran]["seq"] + except Exception as e: + print ("not in fasta", tran) + notinfasta.write("{}\n".format(tran)) + continue + exon_junctions = [] + total_length = len(transeq) + three_len = 1 + five_len = 1 + strand = master_dict[tran]["strand"] + if master_dict[tran]["gene_name"] == "": + master_dict[tran]["gene_name"] = tran + gene = master_dict[tran]["gene_name"] + if gene not in coding_genes_dict: + coding_genes_dict[gene] = False + + if master_dict[tran]["cds"] == []: + tran_type = "noncoding" + cds_start = 'NULL' + cds_stop = 'NULL' + else: + #get utr lengths from annotation + tran_type = "coding" + coding_genes_dict[gene] = True + sorted_exons = sorted(master_dict[tran]["exon"]) + sorted_cds = sorted(master_dict[tran]["cds"]) + min_cds = sorted_cds[0][0] + #Some annotation files do not have utr annotation types, so fix that here if thats the case + if master_dict[tran]["utr"] == []: + for exon_tup in master_dict[tran]["exon"]: + if exon_tup not in master_dict[tran]["cds"]: + # Now check if this overlaps with any of the CDS exons + overlap = False + for cds_tup in master_dict[tran]["cds"]: + if exon_tup[0] == cds_tup[0] and exon_tup[1] != cds_tup[1]: + master_dict[tran]["utr"].append((cds_tup[1],exon_tup[1])) + overlap = True + if exon_tup[0] != cds_tup[0] and exon_tup[1] == cds_tup[1]: + master_dict[tran]["utr"].append((exon_tup[0],cds_tup[0])) + overlap = True + if overlap == False: + master_dict[tran]["utr"].append(exon_tup) + + + ''' + if tran == "NM_001258497": + print ("sorted cds",sorted_cds) + print ("min cds",min_cds) + print ("chrom",master_dict[tran]["chrom"]) + print ("sorted exons", sorted_exons) + print ("utr",master_dict[tran]["utr"]) + sys.exit() + ''' + #if tran == "ENST00000381401": + # print ("min cds,sorted utr",min_cds,sorted(master_dict[tran]["utr"])) + for tup in sorted(master_dict[tran]["utr"]): + #if tran == "ENST00000381401": + # print ("tup", tup) + if tup[0] < min_cds: + five_len += (tup[1]-tup[0])+1 + #if tran == "ENST00000381401": + # print ("adding to fivelen") + elif tup[0] > min_cds: + three_len += (tup[1] - tup[0])+1 + #if tran == "ENST00000381401": + # print ("adding to three len") + else: + pass + if strand == "+": + if len(sorted_exons) > 1: + sorted_exons[0] = (sorted_exons[0][0]-pseudo_utr_len, sorted_exons[0][1]) + sorted_exons[-1] = (sorted_exons[-1][0], sorted_exons[-1][1]+pseudo_utr_len) + else: + sorted_exons[0] = (sorted_exons[0][0]-pseudo_utr_len, sorted_exons[0][1]+pseudo_utr_len) + master_dict[tran]["exon"] = sorted_exons + cds_start = (five_len+pseudo_utr_len) + cds_stop = ((total_length - three_len)-pseudo_utr_len)+1 + elif strand == "-": + if len(sorted_exons) > 1: + sorted_exons[0] = (sorted_exons[0][0]-pseudo_utr_len, sorted_exons[0][1]) + sorted_exons[-1] = (sorted_exons[-1][0], sorted_exons[-1][1]+pseudo_utr_len) + else: + sorted_exons[0] = (sorted_exons[0][0]-pseudo_utr_len, sorted_exons[0][1]+pseudo_utr_len) + master_dict[tran]["exon"] = sorted_exons + cds_start = (three_len+pseudo_utr_len) + cds_stop = ((total_length - (five_len))-pseudo_utr_len)+1 + #if tran == "ENST00000381401": + # print ("cds start, cds stop, five_len, three_len",cds_start,cds_stop,five_len,three_len) + # #sys.exit() + else: + print ("strand is unknown: {}".format(strand)) + sys.exit() + + #get exon junctions, cds is easy just get end of each tuple except last, same for utr except for if same as cds start/stop + total_intronic = 0 + try: + if strand == "+": + tx_start = min(sorted(master_dict[tran]["exon"]))[0] + prev_end = tx_start + for tup in sorted(master_dict[tran]["exon"])[:-1]: + total_intronic += tup[0]-prev_end + exon_junctions.append(((tup[1])-tx_start)-total_intronic) + prev_end = tup[1] + elif strand == "-": + tx_start = max(sorted(master_dict[tran]["exon"]))[-1] + prev_end = tx_start + for tup in (sorted(master_dict[tran]["exon"])[1:])[::-1]: + total_intronic += (tup[0]+1)-prev_end + exon_junctions.append(((tup[1])-tx_start)-total_intronic) + prev_end = tup[1] + except: + if strand == "+": + tx_start = min(sorted(master_dict[tran]["cds"]))[0] + prev_end = tx_start + for tup in sorted(master_dict[tran]["cds"])[:-1]: + total_intronic += tup[0]-prev_end + exon_junctions.append(((tup[1])-tx_start)-total_intronic) + prev_end = tup[1] + elif strand == "-": + tx_start = max(sorted(master_dict[tran]["cds"]))[-1] + prev_end = tx_start + for tup in (sorted(master_dict[tran]["cds"])[1:])[::-1]: + total_intronic += (tup[0]+1)-prev_end + exon_junctions.append(((tup[1])-tx_start)-total_intronic) + prev_end = tup[1] + if strand == "+" and cds_start != "NULL": + master_dict[tran]["cds_start"] = cds_start + master_dict[tran]["cds_stop"] = cds_stop + elif strand == "-" and cds_start != "NULL": + master_dict[tran]["cds_start"] = cds_start + master_dict[tran]["cds_stop"] = cds_stop + master_dict[tran]["strand"] = strand + master_dict[tran]["tran_type"] = tran_type + master_dict[tran]["exon_junctions"] = exon_junctions + +longest_tran_dict = {} +for tran in master_dict: + try: + gene = master_dict[tran]["gene_name"] + except: + continue + if coding_genes_dict[gene] == True: + if "cds_start" in master_dict[tran]: + if master_dict[tran]["cds_stop"] != "NULL" and master_dict[tran]["cds_start"] != "NULL": + cds_length = master_dict[tran]["cds_stop"]- master_dict[tran]["cds_start"] + if gene not in longest_tran_dict: + longest_tran_dict[gene] = {"tran":tran,"length":cds_length} + else: + if cds_length > longest_tran_dict[gene]["length"]: + longest_tran_dict[gene] = {"tran":tran,"length":cds_length} + if cds_length == longest_tran_dict[gene]["length"]: + if master_dict[tran]["length"] > master_dict[longest_tran_dict[gene]["tran"]]["length"]: + longest_tran_dict[gene] = {"tran":tran,"length":cds_length} + else: + length = master_dict[tran]["length"] + if gene not in longest_tran_dict: + longest_tran_dict[gene] = {"tran":tran,"length":length} + elif length > longest_tran_dict[gene]["length"]: + longest_tran_dict[gene] = {"tran":tran,"length":length} + + + + + +for gene in longest_tran_dict: + longest_tran = longest_tran_dict[gene]["tran"] + master_dict[longest_tran]["principal"] = 1 + +gene_sample = [] +for key in list(master_dict)[:10]: + try: + gene_sample.append(master_dict[key]["gene_name"]) + except: + pass + +print ("Here is a sample of the transcript ids: {}".format(list(master_dict)[:10])) +print ("Here is a sample of the gene names: {}".format(gene_sample)) + + +# Takes a transcript, transcriptomic position and a master_dict (see ribopipe scripts) and returns the genomic position, positions should be passed 1 at a time. +def tran_to_genome(tran, start_pos, end_pos, master_dict): + pos_list = [] + for i in range(start_pos,end_pos+1): + pos_list.append(i) + genomic_pos_list = [] + if tran in master_dict: + transcript_info = master_dict[tran] + else: + return ("Null", []) + + chrom = transcript_info["chrom"] + strand = transcript_info["strand"] + exons = transcript_info["exon"] + #print ("chrom,strand,exons",chrom,strand,exons) + for pos in pos_list: + #print ("pos",pos) + if strand == "+": + exon_start = 0 + for tup in exons: + #print ("tup",tup) + exon_start = tup[0] + exonlen = tup[1] - tup[0] + if pos > exonlen: + pos = (pos - exonlen)-1 + else: + break + #print ("appending exon_start-pos", exon_start, pos, exon_start+pos) + genomic_pos_list.append((exon_start+pos)-1) + elif strand == "-": + exon_start = 0 + for tup in exons[::-1]: + #print ("tup",tup) + exon_start = tup[1] + exonlen = tup[1] - tup[0] + #print ("exonlen",exonlen) + if pos > exonlen: + #print ("pos is greater") + pos = (pos - exonlen)-1 + #print ("new pos",pos) + else: + break + #print ("appending exon_start-pos", exon_start, pos, exon_start-pos) + genomic_pos_list.append((exon_start-pos)+1) + return (chrom, genomic_pos_list) + + + + +orf_dict = {"uorf":{}, + "ouorf":{}, + "cds":{}, + "nested":{}, + "odorf":{}, + "dorf":{}, + "minusone":{}, + "readthrough":{}, + "plusone":{}, + "noncoding":{}, + "extension":{}, + "inframe_stop":{} + } + +start_codons = ["ATG","GTG","CTG"] +stop_codons = ["TAG","TAA","TGA"] + + +# Keep track of the longest transcript for each noncoding gene, append this to transcript list later +longest_noncoding = {} + + +tran_count = 0 +# This section is used to gather all cds regions, convert them to genomic regions and store them in a dictionary to check against later (all transcript contribute to this not just those +# in the transcript list) +genomic_cds_dict = {} +tree_dict = {} +for transcript in master_dict: + #print (transcript, master_dict[transcript]["tran_type"]) + tran_count += 1 + if "seq" not in master_dict[transcript]: + continue + chrom = master_dict[transcript]["chrom"] + if chrom not in genomic_cds_dict: + genomic_cds_dict[chrom] = [] + if "cds_start" in master_dict[transcript]: + cds_start = master_dict[transcript]["cds_start"] + cds_stop = master_dict[transcript]["cds_stop"] + if cds_start != "NULL": + cds_pos = [] + for i in range(cds_start, cds_stop+1): + cds_pos.append(i) + + for tup in master_dict[transcript]["cds"]: + if tup[0] != tup[1]: + if tup not in genomic_cds_dict[chrom]: + genomic_cds_dict[chrom].append(tup) + +print ("genomic cds dict built") +print (list(genomic_cds_dict)) +for chrom in genomic_cds_dict: + tree_dict[chrom] = IntervalTree.from_tuples(genomic_cds_dict[chrom]) + +#print (list(tree_dict)) + + +connection = sqlite3.connect("{}".format(sys.argv[6])) +cursor = connection.cursor() +cursor.execute("CREATE TABLE IF NOT EXISTS transcripts (transcript VARCHAR(50), gene VARCHAR(50), length INT(6), cds_start INT(6), cds_stop INT(6), sequence VARCHAR(50000), strand CHAR(1), stop_list VARCHAR(10000), start_list VARCHAR(10000), exon_junctions VARCHAR(1000), tran_type INT(1), gene_type INT(1), principal INT(1), version INT(2),gc INT(3),five_gc INT(3), cds_gc INT(3), three_gc INT(3), chrom VARCHAR(20));") +cursor.execute("CREATE TABLE IF NOT EXISTS coding_regions (transcript VARCHAR(50), coding_start INT(6), coding_stop INT(6));") +cursor.execute("CREATE TABLE IF NOT EXISTS exons (transcript VARCHAR(50), exon_start INT(6), exon_stop INT(6));") +cursor.execute("CREATE TABLE IF NOT EXISTS uorf (transcript VARCHAR(300), start_codon VARCHAR(10), length INT(6), start INT(6), stop INT(6), sequence VARCHAR(50000), cds_coverage FLOAT(20));") +cursor.execute("CREATE TABLE IF NOT EXISTS ouorf (transcript VARCHAR(300), start_codon VARCHAR(10), length INT(6), start INT(6), stop INT(6), sequence VARCHAR(50000), cds_coverage FLOAT(20));") +cursor.execute("CREATE TABLE IF NOT EXISTS cds (transcript VARCHAR(300), start_codon VARCHAR(10), length INT(6), start INT(6), stop INT(6), sequence VARCHAR(50000), cds_coverage FLOAT(20));") +cursor.execute("CREATE TABLE IF NOT EXISTS nested (transcript VARCHAR(300), start_codon VARCHAR(10), length INT(6), start INT(6), stop INT(6), sequence VARCHAR(50000), cds_coverage FLOAT(20));") +cursor.execute("CREATE TABLE IF NOT EXISTS odorf (transcript VARCHAR(300), start_codon VARCHAR(10), length INT(6), start INT(6), stop INT(6), sequence VARCHAR(50000), cds_coverage FLOAT(20));") +cursor.execute("CREATE TABLE IF NOT EXISTS dorf (transcript VARCHAR(300), start_codon VARCHAR(10), length INT(6), start INT(6), stop INT(6), sequence VARCHAR(50000), cds_coverage FLOAT(20));") +cursor.execute("CREATE TABLE IF NOT EXISTS minusone(transcript VARCHAR(300), start_codon VARCHAR(10), length INT(6), start INT(6), stop INT(6), sequence VARCHAR(50000), cds_coverage FLOAT(20));") +cursor.execute("CREATE TABLE IF NOT EXISTS readthrough (transcript VARCHAR(300), start_codon VARCHAR(10), length INT(6), start INT(6), stop INT(6), sequence VARCHAR(50000), cds_coverage FLOAT(20));") +cursor.execute("CREATE TABLE IF NOT EXISTS plusone (transcript VARCHAR(300), start_codon VARCHAR(10), length INT(6), start INT(6), stop INT(6), sequence VARCHAR(50000), cds_coverage FLOAT(20));") +cursor.execute("CREATE TABLE IF NOT EXISTS noncoding (transcript VARCHAR(300), start_codon VARCHAR(10), length INT(6), start INT(6), stop INT(6), sequence VARCHAR(50000), cds_coverage FLOAT(20));") +cursor.execute("CREATE TABLE IF NOT EXISTS extension (transcript VARCHAR(300), start_codon VARCHAR(10), length INT(6), start INT(6), stop INT(6), sequence VARCHAR(50000), cds_coverage FLOAT(20));") +cursor.execute("CREATE TABLE IF NOT EXISTS inframe_stop (transcript VARCHAR(300), start_codon VARCHAR(10), length INT(6), start INT(6), stop INT(6), sequence VARCHAR(50000), cds_coverage FLOAT(20));") +connection.commit(); + + +print ("Finding ORFs") +transcript_count = 0 +total_transcripts = len(list(master_dict)) +for transcript in master_dict: + #print ("transcript",transcript) + #if transcript != "ENST00000316448": + # continue + transcript_count += 1 + if transcript_count%100 == 0: + print ("Transcripts complete: {}/{}".format(transcript_count,total_transcripts)) + if "seq" not in master_dict[transcript]: + print ("transcript {} has no sequence".format(transcript)) + continue + seq = master_dict[transcript]["seq"] + cds_start = "NULL" + cds_stop = "NULL" + transcript_len = len(seq) + if "cds_start" in master_dict[transcript]: + cds_start = master_dict[transcript]["cds_start"] + cds_stop = master_dict[transcript]["cds_stop"] + + #Find out what regions of this transcript overlap with any other coding regions + coding_positions = [] + if cds_start != "NULL": + #If this is a coding transcript don't bother checking the CDS + for i in range(cds_start,cds_stop): + coding_positions.append(i) + #check 5' leader + chrom, pos_list = tran_to_genome(transcript, 0, cds_start, master_dict) + for i in range(0,cds_start): + genomic_pos = pos_list[i] + overlap = tree_dict[chrom][genomic_pos] + if len(overlap) != 0: + coding_positions.append(i) + #check 3' trailer + chrom, pos_list = tran_to_genome(transcript, cds_stop, transcript_len, master_dict) + for i in range(cds_stop,transcript_len+1): + #print ("i",i) + genomic_pos = pos_list[i-cds_stop] + #print ("genomic position",genomic_pos) + overlap = tree_dict[chrom][genomic_pos] + if len(overlap) != 0: + #print ("overlap not empty appending i",overlap) + coding_positions.append(i) + else: + #check entire transcript + chrom, pos_list = tran_to_genome(transcript, 0, transcript_len, master_dict) + for i in range(0,transcript_len): + genomic_pos = pos_list[i] + overlap = tree_dict[chrom][genomic_pos] + if len(overlap) != 0: + coding_positions.append(i) + coding_positions_tuple = to_ranges(coding_positions) + coding_dict[transcript] = coding_positions_tuple + coding_positions = set(coding_positions) + #if this is a coding transcript find the minusone, readhtrough, plusone co-ordinates + if cds_start != "NULL": + if pseudo_utr_len != 0: + cds_stop -= 3 # take 3 from stop so we can match it with orf_stop, do it here rather than above in case cds_stop is null + recoding_dict = {0:"minusone",1:"readthrough",2:"plusone"} + for addition in recoding_dict: + orftype = recoding_dict[addition] + for i in range(cds_stop+addition,transcript_len,3): + if seq[i:i+3] in stop_codons: + orf_seq = seq[cds_stop:i+3] + orf_start = cds_stop + orf_stop = i+2 # +2 so it refers to the end of the stop codon + start_codon = None + if orf_seq: + length = len(orf_seq) + orf_pos_list = [] + #determine how many nucleotides in this orf overlap with an annotated coding region + cds_cov_count = 0.0 + for position in range(orf_start,orf_stop): + orf_pos_list.append(position) + for pos in range(orf_start, orf_stop+1): + if pos in coding_positions: + cds_cov_count += 1 + cds_cov = cds_cov_count/length + cursor.execute("INSERT INTO {} VALUES('{}','{}',{},{},{},'{}',{});".format(orftype, transcript, start_codon, length,orf_start,orf_stop,orf_seq,cds_cov)) + break + for frame in [0,1,2]: + for i in range(frame,transcript_len,3): + if seq[i:i+3] in start_codons: + for x in range(i, transcript_len,3): + if seq[x:x+3] in stop_codons: + orf_seq = seq[i:x+3] + orf_start = i + orf_stop = x+2 # +2 so it refers to the end of the stop codon + start_codon = seq[i:i+3] + length = len(orf_seq) + orf_pos_list = [] + #determine how many nucleotides in this orf overlap with an annotated coding region + cds_cov_count = 0.0 + for pos in range(orf_start, orf_stop+1): + if pos in coding_positions: + cds_cov_count += 1 + cds_cov = float(cds_cov_count)/float(length) + # Now determine orf type + if cds_start == "NULL": + orftype = "noncoding" + else: + #print ("cds start is not null :{}:".format(cds_start)) + if orf_start == cds_start and orf_stop == cds_stop: + orftype = "cds" + elif orf_start < cds_start and orf_stop == cds_stop: + orftype = "extension" + #special case for extensions, we only take from the orf_start to the cds_start, and re-calculate cds coverage + orf_stop = cds_start + cds_cov_count = 0.0 + for pos in range(orf_start, orf_stop+1): + if pos in coding_positions: + cds_cov_count += 1 + cds_cov = float(cds_cov_count)/float(length) + orf_seq = seq[orf_start:cds_start] + length = len(orf_seq) + elif orf_start < cds_start and orf_stop <= cds_start: + orftype = "uorf" + elif orf_start < cds_start and orf_stop > cds_start: + orftype = "ouorf" + elif orf_start >= cds_start and orf_start <= cds_stop and orf_stop <= cds_stop: + if orf_stop == cds_stop: + break + orftype = "nested" + elif orf_start >= cds_start and orf_start <= cds_stop and orf_stop > cds_stop: + orftype = "odorf" + elif orf_start > cds_stop and orf_stop > cds_stop: + orftype = "dorf" + if orf_stop > cds_start and orf_stop < cds_stop: + if (orf_stop+1)%3 == cds_start%3: + orftype = "inframe_stop" + if transcript not in orf_dict: + orf_dict[orftype][transcript] = [] + cursor.execute("INSERT INTO {} VALUES('{}','{}',{},{},{},'{}',{});".format(orftype, transcript, start_codon, length,orf_start,orf_stop,orf_seq,cds_cov)) + break +# Used to keep track of the codons at cds_start and cds_stop positions, +# If there is an issue with the cds co-ordinates the starts and stops counts will +# be much lower than the other count, start with 1 to prevent division by 0 +nuc_dict = {"stops":{"stops":1,"other":0}, "starts":{"starts":1,"other":0}} + +def calcgc(seq): + if seq == "": + return "NULL" + g_count = 0 + c_count = 0 + a_count = 0 + t_count = 0 + for char in seq: + if char == "A": + a_count += 1 + if char == "T": + t_count += 1 + if char == "G": + g_count += 1 + if char == "C": + c_count += 1 + gc = ((g_count+c_count)/float(len(seq)))*100 + return round(gc,2) + + + + +for transcript in master_dict: + #print ("transcripts", transcript) + length = master_dict[transcript]["length"] + cds_start = master_dict[transcript]["cds_start"] + cds_stop = master_dict[transcript]["cds_stop"] + seq = master_dict[transcript]["seq"] + strand = master_dict[transcript]["strand"] + chrom = master_dict[transcript]["chrom"] + gene = master_dict[transcript]["gene_name"] + gc = calcgc(seq) + five_gc = "NULL" + cds_gc = "NULL" + three_gc = "NULL" + if cds_start != "NULL": + five_gc = calcgc(seq[:cds_start]) + cds_gc = calcgc(seq[cds_start:cds_stop]) + three_gc = calcgc(seq[cds_stop:]) + # check that the nucleotide cds_start points to is the first of the start codon + # take one becase cds_start is 1 based but python indexing is 0 based + start_nuc = seq[cds_start-1:cds_start+2] + #print ("start nuc",start_nuc) + if start_nuc == "ATG": + nuc_dict["starts"]["starts"] += 1 + else: + nuc_dict["starts"]["other"] += 1 + stop_nuc = seq[cds_stop-3:cds_stop] + #print ("stop_nuc",stop_nuc) + if stop_nuc in ["TAG","TAA","TGA"]: + nuc_dict["stops"]["stops"] += 1 + else: + nuc_dict["stops"]["other"] += 1 + tran_type = master_dict[transcript]["tran_type"] + if coding_genes_dict[gene] == True: + gene_type = 1 + else: + gene_type = 0 + #print ("tran type before",tran_type) + if tran_type == "coding": + tran_type = 1 + else: + tran_type = 0 + #print ("tran type after",tran_type) + start_list = str(master_dict[transcript]["start_list"]).replace(" ","").strip("[]") + stop_list = str(master_dict[transcript]["stop_list"]).replace(" ","").strip("[]") + exon_junctions = str(master_dict[transcript]["exon_junctions"]).replace(" ","").strip("[]") + principal = master_dict[transcript]["principal"] + version = master_dict[transcript]["version"] + #print (master_dict[transcript]) + #print (tran_type) + #print (gene_type) + #print (principal) + #print (version) + #print ("INSERT INTO transcripts VALUES('{}','{}',{},{},{},'{}','{}','{}','{}','{}',{},{},{},{});".format(transcript, gene, length, cds_start, cds_stop, seq, strand,stop_list, start_list, exon_junctions, tran_type,gene_type,principal,version)) + cursor.execute("INSERT INTO transcripts VALUES('{}','{}',{},{},{},'{}','{}','{}','{}','{}',{},{},{},{},{},{},{},{},'{}');".format(transcript, gene, length, cds_start, cds_stop, seq, strand,stop_list, start_list, exon_junctions, tran_type,gene_type,principal,version,gc,five_gc,cds_gc,three_gc,chrom)) + + for tup in master_dict[transcript]["exon"]: + cursor.execute("INSERT INTO exons VALUES('{}',{},{});".format(transcript,tup[0],tup[1])) + if transcript in coding_dict: + for tup in coding_dict[transcript]: + cursor.execute("INSERT INTO coding_regions VALUES('{}',{},{});".format(transcript,tup[0],tup[1])) + +connection.commit() +connection.close() + +if (nuc_dict["starts"]["other"]/nuc_dict["starts"]["starts"]) > 0.05: + print ("Warning: {} transcripts do not have a an AUG at the CDS start position".format(nuc_dict["starts"]["other"])) +if (nuc_dict["stops"]["other"]/nuc_dict["stops"]["stops"]) > 0.05: + print ("Warning: {} transcripts do not have a an stop codon at the CDS stop position".format(nuc_dict["stops"]["other"])) +if len(notinannotation) >0: + print ("Warning: {} transcripts were in the fasta file, but not the annotation file, these will be discarded".format(len(notinannotation))) diff -r 6cbd0a215724 -r b15d43a50435 trips_create_new_organism/create_annotation_sqlite.xml --- /dev/null Thu Jan 01 00:00:00 1970 +0000 +++ b/trips_create_new_organism/create_annotation_sqlite.xml Tue Mar 29 12:41:16 2022 +0000 @@ -0,0 +1,86 @@ + + + python-intervaltree + pysqlite3 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +@misc{githubTrips-Viz, + author = {LastTODO, FirstTODO}, + year = {TODO}, + title = {Trips-Viz}, + publisher = {GitHub}, + journal = {GitHub repository}, + url = {https://github.com/skiniry/Trips-Viz}, +} + + diff -r 6cbd0a215724 -r b15d43a50435 trips_create_new_organism/test-data/sacCer3_transcripts.fasta --- /dev/null Thu Jan 01 00:00:00 1970 +0000 +++ b/trips_create_new_organism/test-data/sacCer3_transcripts.fasta Tue Mar 29 12:41:16 2022 +0000 @@ -0,0 +1,271320 @@ +>YAL012W +GACCCCATACCACTTCTTTTTGTTATTCTTAAATATGTTGTAACGCTATG +TAATTCCACCCTTCATTACTAATAATTAGCCATTCACGTGATCTCAGCCA +GTTGTGGCGCCACACTTTTTTTTCCATAAAAATCCTCGAGGAAAAGAAAA +GAAAAAAATATTTCAGTTATTTAAAGCATAAGATGCCAGGTAGATGGAAC +TTGTGCCGTGCCAGATTGAATTTTGAAAGTACAATTGAGGCCTATACACA +TAGACATTTGCACCTTATACATATACACACAAGACAAAACCAAAAAAAAT +ATGACTCTACAAGAATCTGATAAATTTGCTACCAAGGCCATTCATGCCGG +TGAACATGTGGACGTTCACGGTTCCGTGATCGAACCCATTTCTTTGTCCA +CCACTTTCAAACAATCTTCTCCAGCTAACCCTATCGGTACTTACGAATAC +TCCAGATCTCAAAATCCTAACAGAGAGAACTTGGAAAGAGCAGTTGCCGC +TTTAGAGAACGCTCAATACGGGTTGGCTTTCTCCTCTGGTTCTGCCACCA +CCGCCACAATCTTGCAATCGCTTCCTCAGGGCTCCCATGCGGTCTCTATC +GGTGATGTGTACGGTGGTACCCACAGATACTTCACCAAAGTCGCCAACGC +TCACGGTGTGGAAACCTCCTTCACTAACGATTTGTTGAACGATCTACCTC +AATTGATAAAGGAAAACACCAAATTGGTCTGGATCGAAACCCCAACCAAC +CCAACTTTGAAGGTCACCGACATCCAAAAGGTGGCAGACCTTATCAAGAA +GCACGCTGCCGGCCAAGACGTGATCTTGGTTGTCGACAACACCTTCTTGT +CCCCATATATCTCCAATCCATTGAACTTCGGTGCAGACATCGTTGTCCAC +TCCGCTACAAAGTACATCAACGGTCACTCAGACGTTGTGCTCGGTGTCCT +GGCCACTAATAACAAGCCATTGTACGAGCGTCTGCAGTTCTTACAAAACG +CCATTGGTGCTATCCCATCTCCTTTCGATGCTTGGTTGACCCACAGAGGT +TTGAAGACTTTGCATCTACGTGTCAGACAAGCTGCCCTCAGCGCCAACAA +AATCGCTGAATTCTTGGCAGCAGACAAGGAAAACGTTGTCGCAGTCAACT +ACCCAGGTTTGAAGACACACCCTAACTACGACGTAGTGTTAAAGCAACAC +CGTGATGCCCTTGGTGGTGGTATGATCTCCTTCAGAATCAAGGGTGGTGC +TGAAGCTGCTTCCAAGTTCGCCTCCTCCACAAGACTGTTCACATTGGCCG +AATCCCTTGGTGGTATCGAATCTCTATTGGAAGTGCCCGCTGTGATGACC +CACGGTGGTATCCCAAAGGAGGCCAGAGAGGCCTCTGGTGTTTTTGACGA +CTTGGTTAGAATCTCTGTCGGTATTGAAGACACTGACGATCTTTTGGAAG +ACATCAAGCAAGCCTTGAAACAAGCCACCAACTAATCGCCAGTGCCACGT +CTCTGCCTTCGACCGGACCTTTTTAAGTACGATAAATATCCTTTTATAAA +TATATAGTCTAAAATATCCATTAATACTGTGCTCAATCAATCGTGTTAGA +TGATTTAGTTTTTTCCAAATCGTTATTATAGTGCAGAAGTAGTATACATA +AAGGCATATGCATGCGATTTGGAAGTAACGCTCGCCGTAGACAAGTAAGA +ATGCCTGCTGTCTTGAGAACCAGGTCCAAAGAATCCTCTATAGAGCAGAA +GCCTGCTTCCAGAACTAGAACGAGATCAAGAAGGG +>YAL069W +CACACCACACCACACCCACACACACACATCCTAACACTACCCTAACACAG +CCCTAATCTAACCCTGGCCAACCTGTCTCTCAACTTACCCTCCATTACCC +TGCCTCCACTCGTTACCCTGTCCCATTCAACCATACCACTCCGAACCACC +ATCCATCCCTCTACTTACTACCACTCACCCACCGTTACCCTCCAATTACC +CATATCCAACCCACTGCCACTTACCCTACCATTACCCTACCATCCACCAT +GACCTACTCACCATACTGTTCTTCTACCCACCATATTGAAACGCTAACAA +ATGATCGTAAATAACACACACGTGCTTACCCTACCACTTTATACCACCAC +CACATGCCATACTCACCCTCACTTGTATACTGATTTTACGTACGCACACG +GATGCTACAGTATATACCATCTCAAACTTACCCTACTCTCAGATTCCACT +TCACTCCATGGCCCATCTCTCACTGAATCAGTACCAAATGCACTCACATC +ATTATGCACGGCACTTGCCTCAGCGGTCTATACCCTGTGCCATTTACCCA +TAACGCCCATCATTATCCACATTTTGATATCTATATCTCATTCGGCGGTC +CCAAATATTGTATAACTGCCCTTAATACATACGTTATACCACTTTTGCAC +CATATACTTACCACTCCATTTATATACACTTATGTCAATATTACAGAAAA +ATCCCCACAAAAATCACCTAAACATAAAAATATTCTACTTTTCAACAATA +ATACATAAACATATTGGCTTGTGGTAGCAACACTATCATGGTATCACTAA +CGTAAAAGTTCCTCAATATTGCAATTTGCTTGAACGGATGCTATTTCAGA +ATATTTCGTACTTACACAGGCCATACATTAGAATAATATGTCACATCACT +GTCGTAACACTCTTT +>YAL068W_A +ATCCAACCCACTGCCACTTACCCTACCATTACCCTACCATCCACCATGAC +CTACTCACCATACTGTTCTTCTACCCACCATATTGAAACGCTAACAAATG +ATCGTAAATAACACACACGTGCTTACCCTACCACTTTATACCACCACCAC +ATGCCATACTCACCCTCACTTGTATACTGATTTTACGTACGCACACGGAT +GCTACAGTATATACCATCTCAAACTTACCCTACTCTCAGATTCCACTTCA +CTCCATGGCCCATCTCTCACTGAATCAGTACCAAATGCACTCACATCATT +ATGCACGGCACTTGCCTCAGCGGTCTATACCCTGTGCCATTTACCCATAA +CGCCCATCATTATCCACATTTTGATATCTATATCTCATTCGGCGGTCCCA +AATATTGTATAACTGCCCTTAATACATACGTTATACCACTTTTGCACCAT +ATACTTACCACTCCATTTATATACACTTATGTCAATATTACAGAAAAATC +CCCACAAAAATCACCTAAACATAAAAATATTCTACTTTTCAACAATAATA +CATAAACATATTGGCTTGTGGTAGCAACACTATCATGGTATCACTAACGT +AAAAGTTCCTCAATATTGCAATTTGCTTGAACGGATGCTATTTCAGAATA +TTTCGTACTTACACAGGCCATACATTAGAATAATATGTCACATCACTGTC +GTAACACTCTTTATTCACCGAGCAATAATACGGTAGTGGCTCAAACTCAT +GCGGGTGCTATGATACAATTATATCTTATTTCCATTCCCATATGCTAACC +GCAATATCCTAAAAGCATAACTGATGCATCTTTAATCTTGTATGTGACAC +TACTC +>YAL068C +TGCGCATACGAATACACATAAGCGCCATAAAACAGTACTCCACATACGAA +ACCTATGAAAGATTTATGATTCGTTCAGAAACAAGAGCATCTCCATAGAG +ATAATGAGATTGTGTGAAAGATGAGATATAGAGAATATTTGATGAGGAAC +TGGTGCCAGTCAGCGATCGTTTAAATAGCAACAACCCATGAGGGAATGGG +TATAAATAGAGCTGCTTCAACTATATGCCTTTGAGAATATGTCTTTATTC +TTTCCTTTCCTGTTAAGCTTATATCAGCACTAACAAACAAAACAAATACA +ATGGTCAAATTAACTTCAATCGCCGCTGGTGTCGCTGCCATCGCTGCTAC +TGCTTCTGCAACCACCACTCTAGCTCAATCTGACGAAAGAGTCAACTTGG +TGGAATTGGGTGTCTACGTCTCTGATATCAGAGCTCACTTAGCCCAATAC +TACATGTTCCAAGCCGCCCACCCAACTGAAACCTACCCAGTCGAAGTTGC +TGAAGCCGTTTTCAACTACGGTGACTTCACCACCATGTTGACCGGTATTG +CTCCAGACCAAGTGACCAGAATGATCACCGGTGTTCCATGGTACTCCAGC +AGATTAAAGCCAGCCATCTCCAGTGCTCTATCCAAGGACGGTATCTACAC +TATCGCAAACTAGAGACAAACGCCAATTTTACGAACGGGTTTCCATAGAA +ATTGAAAATTAACGAACAAAATAAAATAAAAAAACTACTTTTTTTTGATG +ATATAAATACCGTAGATTATATAAATGTATATTAATATTATAGACCTATT +TGATCAATGACGGTGTTCGTGAAGCATTTTATGAATACGATGAACATAAG +AAAGAAACTTCTACACTATTGTAGAAAAAACGTGGACGGTAATAAAGCTA +ACAGTGTATGTCCAATAAACAACAATGAAATTGGAAATGTGCGGCTTCGC +AACCTTTGTCCTT +>YAL067W_A +TTGTTTGTTAGTGCTGATATAAGCTTAACAGGAAAGGAAAGAATAAAGAC +ATATTCTCAAAGGCATATAGTTGAAGCAGCTCTATTTATACCCATTCCCT +CATGGGTTGTTGCTATTTAAACGATCGCTGACTGGCACCAGTTCCTCATC +AAATATTCTCTATATCTCATCTTTCACACAATCTCATTATCTCTATGGAG +ATGCTCTTGTTTCTGAACGAATCATAAATCTTTCATAGGTTTCGTATGTG +GAGTACTGTTTTATGGCGCTTATGTGTATTCGTATGCGCAGAATGTGGGA +ATGCCAATTATAGGGGTGCCGAGGTGCCTTATAAAACCCTTTTCTGTGCC +TGTGACATTTCCTTTTTCGGTCAAAAAGAATATCCGAATTTTAGATTTGG +ACCCTCGTACAGAAGCTTATTGTCTAAGCCTGAATTCAGTCTGCTTTAAA +CGGCTTCCGCGGAGGAAATATTTCCATCTCTTGAATTCGTACAACATTAA +ACGTGTGTTGGGAGTCGTATACTGTTAGGGTCTGTAAACTTGTGAACTCT +CGGCAAATGCCTTGGTGCAATTACGTAATTTTAGCCGCTGAGAAGCGGAT +GGTAATGAGACAAGTTGATATCAAACAGATACATATTTAAAAGAGGGTAC 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